本技术介绍了一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产谷胱甘肽的新方法。该方法通过基因工程技术敲除宿主菌中的半胱氨酸脱硫酶和谷氨酰转肽酶基因,优化发酵条件,实现谷胱甘肽的高效生产。该技术具有生产效率高、成本低、易于规模化生产等优点,可广泛应用于医药、保健品等领域。
背景技术
谷胱甘肽通常由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS,EC 6.3.2.2,GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GS,EC 6.3.2.3,GSH II)或双功能谷胱甘肽合成酶GshF催化合成,需要三种前体L-谷氨酸、L-半胱氨酸和L-甘氨酸合成,消耗两分子ATP。谷胱甘肽作为一种非蛋白硫醇类化合物,广泛应用于医药、食品、化妆品和保健品中,可用于稳定化学和生物试剂的色素。作为环境污染指标;它被用作食品添加剂,以延长肉类和水果的保质期,并以胶囊形式作为食品补充剂。近年来,谷胱甘肽的商业需求呈现出增长的总体趋势。
目前,Yang等人(Applied Microbiology andBiotechnology(2016),100(14),6279-6289.在加入80mMATP后,全细胞催化体系最终产生11.2g/L谷胱甘肽;Chen等人(World Journal ofMicrobiology and Biotechnology(2020),36(8),117.)通过系统探索发酵过程中温度、pH等因素,研究了一种基于氧化应激和能量代谢逐渐调节酵母谷胱甘肽合成的方法,谷胱甘肽积累量增加至5.76g/L,是对照组的2.84倍;Liu等人(Journal ofIndustrial Microbiology and Biotechnology(2019),46(12),1685-1695)在谷氨酸棒杆菌中利用GshF生产谷胱甘肽,改造关键前体L-半胱氨酸途径,发酵生产756mg/L谷胱甘肽;韦建国等人在发酵过程需要补加L-谷氨酸、L-甘氨酸和L-半胱氨酸三种氨基酸,利用重组谷氨酸棒杆菌合成谷胱甘肽,产量为24.95g/L,转化率为81.2%(中国专利,CN112646768A,2021)。然而,谷胱甘肽合成酶在酶法合成中存在ATP能量供应和半衰期短的局限性,且化学合成不具有特异性,酵母中GSH对关键酶GSH I的反馈抑制、大肠杆菌对前体半胱氨酸耐受低等问题导致GSH产量和生产力通常相当低;同时,温度、pH、通气、搅拌等发酵参数也会影响产物谷胱甘肽的稳定;三种底物氨基酸的添加会造成成本高的问题。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是氨基酸发酵产业的核心菌株,具有良好的底物耐受性能力,由于具有生物安全(美国FDA认定为GRAS,Generally regardedas safe)、天然的L-谷氨酸(GSH前体)分泌菌株、底物谱广等优势,广泛应用于发酵法生产谷氨酸、赖氨酸和缬氨酸等。因此,底盘细胞的筛选、多模块代谢途径的重构和发酵参数的优化是提高谷胱甘肽生物合成的必要条件;开发一种提高食品安全菌株谷氨酸棒杆菌生产谷胱甘肽产量的方法,能够简化生产工艺、提高合成效率、降低生产成本,对谷胱甘肽的应用有重要的实践意义。此外,从微生物中获得的单细胞蛋白(SCP)作为继植物和昆虫蛋白之后具有巨大潜力,以谷氨酸棒状杆菌为基础的SCP可以作为动物饲料,支持猪的生长、改善动物肠道菌群;并具有抗肥胖的作用。
实现思路