本技术方案涉及一种高灵敏度的DNA基因突变、扩增和染色体CNV联合检测方法,适用于基因检测技术。该方法包括构建包含原始模板DNA和目标区域扩增片段的测序文库,并通过测序获得结果,其中全基因组测序深度为1X-3X,目标区域测序深度不低于1000X。该技术方案对DNA起始量要求极低,能在单一文库中实现多种检测,提高检测灵敏度和适用范围,简化操作步骤,降低劳动强度,特别适合特殊场景下的应用。
背景技术
基因突变检测是现代医学和生物学研究中的一个重要领域,在疾病的诊断、治疗以及预防方面发挥着至关重要的作用。随着基因突变检测技术的发展,临床上肿瘤突变基因的检测已得到广泛应用,尤其是靶向药物用于肿瘤患者治疗前,按照国内外指南要求必须先进行基因检测。比如在非小细胞肺癌中,EGFR(表皮生长因子受体)基因突变与癌症患者的治疗选择密切相关。特定的EGFR突变,如外显子19缺失和外显子21的p.L858R点突变,与对口服EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗的敏感性相关。而KRAS突变与EGFR TKI治疗的低响应率相关,其突变状态的检测有助于预测患者对EGFR TKI治疗的可能反应。此外,KRAS突变也是预后不良的指标。在成人弥漫性胶质瘤中,IDH1/2、pTERT基因突变的检测已成为分子分型的重要标准。目前常用的基因检测手段包括Sanger测序、数字滴定聚合酶链反应(Droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)和高通量二代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)。其中Sanger测序对碱基的识别准确性非常高,错误率极低,但成本较高,读长有限,而且需要的DNA量较多,一般需2 μg DNA。qPCR成本较低,实验耗时较短,而且可以兼容多重反应达到检测多个靶标的目的,但该方法严重依赖引物和探针的特异性,且存在一定的非特异性扩增,同时,该方法无法检测复杂的插入和缺失突变。ddPCR能够检测到极低丰度的目标DNA,灵敏度和准确度都非常高,且能够对目标分子进行绝对定量,但该方法也存在一些缺点,如成本较高,操作繁琐,通量有限。上述三种检测方法均无法同时获得基因突变和基因组CNV的信息。NGS技术引入可逆终止末端,实现边合成边测序。可获得大量位点的信息,包括基因突变、基因融合和染色体变异(CNV)等信息。为获取目标区域的突变信息,目前常采用的建库方式为杂交捕获和扩增子建库方式,但杂交捕获建库方式需对目标区域设计特异性探针,且要求起始DNA量较大,一般需100-200 ng DNA,操作流程复杂,很多临床样本无法满足其要求,使许多肿瘤患者失去宝贵的靶向药物治疗机会。另外,如需同时获得基因突变与染色体变异信息,需设计大量的探针,极大增加了设计难度和检测成本;扩增子建库方式虽然可以降低对起始DNA量的要求,但只能获得少量目标区域的突变信息,无法同时获得染色体的CNV信息。
常见临床样本类型包括手术或穿刺获取的组织样本,以及血液、胸腔积液、尿液和脑脊液等液体样本。除手术获取的组织和部分石蜡包埋样本外,大部分的样本很难获得足够的基因组DNA进行分子病理检测。如穿刺活检作为肿瘤早期诊断的常用技术之一,其获取的组织体积大约为7-9 mm3
/条,在进行组织病理检查后余下组织较难获得DNA进行分子检测。为最大化使用该活检组织获得明确病理类型诊断和分子基因的检测,临床上亟需一种对起始DNA量要求低,能同时获得多种DNA变异信息的技术。
实现思路