本技术属于生物医药技术领域,详细描述了一种制备人诱导多能干细胞衍化心肌细胞(hiPSCs-CMs)来源的细胞外囊泡(EVs)的方法及其产品和应用。该方法通过使用和厚朴酚预处理hiPSCs-CMs,随后培养以收集其分泌的EVs。经和厚朴酚预处理的hiPSCs-CMs分泌的EVs富含功能性线粒体,在动物模型中显示出优越的心肌梗死治疗效果,预示着其在临床治疗中的巨大潜力。
背景技术
诱导性多能干细胞(iPSCs)技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。由于人诱导多能干细胞(hiPSCs)具有体外降低免疫排斥和无限繁殖等优势,人诱导多能干细胞分化来源的心肌细胞(hiPSC-CMs)为心脏修复、心脏药物测试、体外心脏建模等提供了理想细胞来源。
心肌梗死(心梗,MI)是指心肌缺血性的坏死,是一种发病率和死亡率都很高的世界性疾病。成人的心肌是人体内再生能力最弱的组织之一,心梗将导致大量死亡的心肌细胞无法得到补充,因此外源补充健康心肌细胞的细胞治疗是未来治疗心梗的主要方向之一。
随着干细胞研究的深入,hiPSCs-CMs移植用于心肌梗死治疗的探索显示了其应用前景(Cao,Nan et al.“Highly efficient induction and long-term maintenance ofmultipotent cardiovascular progenitors from human pluripotent stem cellsunder defined conditions.”Cell research vol.23,9(2013):1119-32;Jiang,Xin etal.“Cardiac repair in a murine model of myocardial infarction withhumaninducedpluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.”Stem cell research&therapy vol.11,1297.17Jul.2020)。理论上,将心肌谱系细胞移植到发生心梗的心脏可以补充因损伤死亡的心肌细胞,但在现实中由于心肌梗死区域存在的炎性微环境使得移植的心肌细胞存活率较低、细胞移植疗效有限。
细胞外囊泡(EVs)是一种小的膜囊泡。研究显示,EVs可以提供类似于细胞治疗的效果,同时能够避免与细胞治疗应用相关的诸如免疫反应的一些风险,因此目前已被广泛研究作为细胞治疗的潜在替代方法。
目前,越来越多的证据表明少数成功植入受体心脏的心肌细胞并不能直接修复受损心肌,而是以“旁分泌”,即分泌EVs的形式发挥有限的作用(Yang,Lihong et al.“Stemcell-derived extracellular vesicles for myocardial infarction:a meta-analysisof controlled animal studies.”Agingvol.11,4(2019):1129-1150.)。一些研究表明,持续将从诱导多能干细胞分化的心肌细胞分泌的EVs运送到心脏中可能帮助治疗心脏损伤(Liu,Bohao et al.“Cardiac recovery via extended cell-free delivery ofextracellular vesicles secreted by cardiomyocytes derived frominducedpluripotent stem cells.”Nature biomedical engineering vol.2,5(2018):293-303.)。
关于EVs发挥心功能改善作用的具体机制,已经知晓的是EVs含有丰富的生物活性RNA、蛋白质、脂质和代谢产物,EVs从供体细胞转移到受体细胞后可通过这些生物活性物质影响后者的生物学特性。此外,有研究报道,人诱导多能干细胞衍化心肌细胞来源的细胞外囊泡(HiPSC-CMs-EVs)对心肌梗死小鼠心功能具有改善作用是通过线粒体转移这一途径实现的(Ikeda,Gentaro et al.“Mitochondria-Rich Extracellular Vesicles FromAutologous Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Restore Energetics of IschemicMyocardium.”Journal of the American College ofCardiology vol.77,8(2021):1073-1088.)。
众所周知,线粒体是细胞能量代谢和信号传导的中心,在调控物质和能量代谢、氧化还原状态、信号传递和细胞存活与死亡等过程中发挥了关键作用,被认为是调控免疫反应、炎症和组织再生的重要细胞器。EVs介导的线粒体转移也被证实具有修复损伤受体细胞的代谢功能等作用(Zhou,Xiyue et al.“MitoEVs:A new player in multiplediseasepathology and treatment.”Journal ofextracellular vesicles vol.12,4(2023):e12320.)。
因此,制备富含线粒体的hiPSCs-CMs源的EVs,利用线粒体动力学来调节能量学并促进EVs的代谢重塑,从而提高EVs的质量,对心梗治疗具有较好的应用前景和研究意义。
实现思路