本技术介绍了一种新型的反义寡核苷酸与正义寡核苷酸偶联分子(ASSOC),该分子由三部分组成:反义链(ASO)、正义链(SO)以及连接两者的连接子。该偶联分子在生物医学领域具有广泛的应用前景。
背景技术
反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)是一类能够通过碱基互补配对与靶标RNA结合并调控RNA翻译的短链核酸分子。ASO可以利用RNA酶H1介导的RNA降解、杂交占位RNA翻译抑制以及外显子跳跃等生物机制对疾病相关蛋白的表达进行精准的下调或上调。这些功能使得ASO可以被用于疾病的精准治疗,目前已有12款ASO药物被批准用于临床。这些ASO药物在治疗杜氏肌营养不良症(DMD)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)以及家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)等疾病中展现出良好的疗效。除此之外,还有大量的研究表明ASO在传染病、癌症、心血管疾病以及自身免疫性疾病等疾病治疗方面具有巨大的应用前景(Nat.Rev.Drug Discov.2021,20,427)。
然而ASO药物也存在严重的毒副作用问题,这是限制ASO药物大规模临床应用的一个重要因素(Nucleic Acid Ther.2023,33,1)。已有多种ASO药物因严重的肝毒性问题被迫中止临床研究(如用于治疗前列腺癌的EZN-4176以及用于治疗血脂异常的vupanorsen)。即使是已通过临床审批的ASO,在使用过程中也会造成肝损伤(如mipomersen、inotersen、volanesorsen等)。目前已知的造成ASO药物肝毒性的机制可分为两类:一类是ASO的化学成分引起的细胞蛋白紊乱;另一类是ASO结合非靶标RNA造成的RNA功能紊乱,即脱靶效应。对于第一类机制,已有多项研究表明通过特定化学修饰可以进行有效的抑制(Nat.Biotechnol.2019,37,640;Nucleic Acids Res.2022,50,7224)。而对于脱靶效应,目前并没有非常有效的方法进行抑制。
虽然ASO药物被期望只作用于与其序列完全互补的RNA底物,但这在实践中却很难实现。实际上,在生理条件下,ASO也能够与非完全互补的RNA结合并影响RNA翻译。TodM.Woolf等人曾报道即使存在9个碱基的错配,长度为25个碱基的ASO仍能在活体中有效降解RNA底物(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1992,89,7305)。这种高错配容忍度使ASO药物很容易影响正常蛋白的表达而产生脱靶毒性。此类ASO脱靶毒性能够引起细胞凋亡和肝毒性(Nucleic Acids Res.2016,44,2093;Mol.Ther.Nucleic Acids 2018,10,45)。针对这一问题,寡核苷酸安全工作小组(Oligonucleotide Safety Working Group)建议要对ASO序列进行计算机模拟筛选,选择具有更少潜在脱靶位点的序列(Nat.Biotechnol.2012,30,920)。然而这一做法也难以避免脱靶毒性。一方面,人类基因组数量庞大,所产生的RNA序列种类十分多样;另一方面,RNA酶H对DNA/RNA双链错配的容忍度高,使潜在的脱靶序列数量也非常多。例如,对于长度为20个碱基的ASO,与其序列有5个以内碱基错配的外显子RNA平均数量超过200个(Genes Cells 2018,23,448)。所以开发抑制ASO脱靶毒性的策略十分必要。汤新景课题组发现在模型反应中环状ASO具有比线性ASO更低的脱靶效应,但其在细胞或活体层面的脱靶效应未见报道(J.Med.Chem.2021,64,16046)。Takao Inoue课题组报道,长度为18个碱基的gapmer ASO比长度为14个碱基的gapmer ASO具有更低的脱靶效应,暗示可以通过增长ASO长度降低脱靶效应(Mol.Diagn.Ther.2022,26,117)。但这一发现并不能形成一个通用的策略。这主要是由于ASO长度增加会造成与RNA结合力上升,对错配的容忍度以及可能的错配底物也快速增加,这反而有可能增加脱靶效应。因此对于不同的ASO,最佳的序列和长度仍需通过大量实验筛选。最近,Tsuyoshi Yamamoto课题组报,在ASO链上通过碱基互补配对杂交一段肽核酸可以提升ASO的特异性(Nat.Commun.2023,14,7972)。这一研究说明通过在ASO链上预先杂交一段有义链可以提升ASO链结合RNA的选择性。然而,这种分子间杂交的结构并不稳定,依赖于使用具有高亲和力的特殊核酸链且无法保证正义链和ASO链的比例固定,使得这一策略在实际应用中有很大的不确定性。总之,虽然ASO药物的选择性问题长期限制其临床应用,但目前仍没有有效方法解决这一问题。
实现思路