本技术涉及生物医药领域,介绍了一种利用马克斯克鲁维酵母制备禽传染性法氏囊病VP2纳米颗粒口服疫苗的方法及其应用。通过筛选、组装和制备,开发出适用于马克斯克鲁维酵母的疫苗制备工艺,旨在提高疫苗的免疫效果和应用范围。
背景技术
传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是世界动物卫生组织(OIE)所规定的需通报的疾病之一。IBD发病率高,病程短,危害性大,严重威胁养殖业的发展,因此,预防和治疗IBD对禽类养殖有着重要意义。IBD具有法氏囊高度肿大或者萎缩,肾脏高度肿大及尿酸盐沉积,法氏囊,腿肌,胸肌,腺胃和肌胃交界处出血等特病理特性。法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官,是B细胞成熟的场所,被诱导分化成熟的B细胞受到抗原刺激后可转化为浆细胞产生抗体,参与特异性体液免疫。IBD主要侵害3-12周龄的雏鸡和青年鸡,会导致法氏囊坏死和萎缩,进而使幼龄鸡法氏囊未成熟的B淋巴细胞大量被破坏,形成严重的免疫抑制,从而易出现继发感染和免疫失败,带来巨大的经济损失,因此,该病受到了养殖业的高度重视,同时也成为学术界关注和研究的热点。VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白,编码441个氨基酸,分子质量约为37-40kDa,占病毒蛋白总量的51%,位于病毒粒子的外表面,与VP3共同构成核衣壳的骨架。VP2含有病毒主要的中和性抗原表位,可诱导机体产生具有血清学特异性的保护性中和抗体,保护宿主不受IBDV感染,它还具有自装成病毒颗粒的特性,是研究IBDV亚单位疫苗的靶蛋白。
马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus,KM)是一种非常规酵母,与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同属于Saccharomycetaceae科,是美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)的GRAS认证(Generally recognized as safe,食品添加剂安全评价)和欧盟食品安全局(European Food Safety Authority,简称EFSA)的QPS认证(Qualified Presumption of Safety,安全资格认证)的安全酵母,也被中国卫计委批准为新食品原料。申请人于2013年在湖北黄陂自然养殖土猪场成功分离出一株KM-C2株(CN103952324A),并于2014年3月3日送往中国湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心进行保藏(CCTCC NO:M2014059)。该菌株对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲毒素A的生物降解率达80%以上,同时可用于动物口服解毒。因此,该菌株非常适合作为出发菌株,并作为携带IBDV纳米颗粒的口服载体应用于饲料添加剂中。
目前该菌株尚无可用于食用安全级别酵母表达系统的营养缺陷筛选标记及可以对该菌株进行遗传改造的敲除载体。也没有适用于该菌株的表达载体。鉴于此,本发明为该菌株建立适合的遗传操作体系,实现在酵母基因组上的遗传操作。为该菌株匹配不同的启动子-终止子组合及复制子组合,提供新型候选表达元件。另外,将本发明应用至IBDV-VP2纳米颗粒基因工程疫苗,为进一步开发IBDV疫苗奠定基础,也为其他动物病原基因工程疫苗的制备提供借鉴。
针对上述问题,申请人提供了适用于马克斯克鲁维酵母的双复制子表达载体并进行了专利申请,申请号为2024104862538(本申请提交前未公开),在该申请中,申请人全新构建了适用于马克斯克鲁维酵母的双复制子表达载体,该表达载体具有稳定性好,外源蛋白表达量大,转化率高的优点。在本发明中,申请人进一步利用该复制子,制备了禽法氏囊病毒VP2纳米颗粒口服疫苗,为禽法氏囊病口服疫苗奠定基础。
实现思路