本技术涉及生物医药技术,揭示了一种马克斯克鲁维酵母高效稳定表达犬细小病毒VP2纳米颗粒的技术。申请人经过筛选和组装,成功制备了适用于马克斯克鲁维酵母的双复制子表达系统,实现了VP2纳米颗粒的高效稳定表达。
背景技术
犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)最初来源于猫泛白细胞减少症细小病毒(Feli ne Panleukopenia Virus,FPV),它是猫细小病毒基因突变衍变而来。犬细小和猫细小病毒的基因序列相似度高达99%,但二者具有不同的抗原特性、宿主范围和血细胞凝集特性。自1978年在美国发现犬细小病毒以来,该病毒在全世界快速流行并严重威胁着养犬业的发展。由于病毒变异率高和犬类不及时进行疫苗接种,导致感染动物发病率和死亡率高。马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus,KM)是一种非常规酵母,与酿酒酵母(Saccharomy ces cerevisiae)同属于Saccharomycetaceae科,是美国食品药品监督管理局(Food and Dru g Administration,FDA)的GRAS认证(Generally recognized as safe,食品添加剂安全评价)和欧盟食品安全局(European Food Safety Authority,简称EFSA)的QPS认证(Qua lified Presumption of Safety,安全资格认证)的安全酵母,也被中国卫计委批准为新食品原料。申请人于2013年在湖北黄陂自然养殖土猪场成功分离出一株KM-C2株(CN103952324A),并于2014年3月3日送往中国湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心进行保藏(CCTCC NO:M2014059)。该菌株对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲毒素A的生物降解率达80%以上,同时可用于动物口服解毒。因此,该菌株非常适合作为出发菌株,并作为携带CPV抗原的口服载体应用于饲料添加剂中。
目前该菌株尚无可用于食用安全级别酵母表达系统的营养缺陷筛选标记及可以对该菌株进行遗传改造的敲除载体。也没有适用于该菌株的表达载体。鉴于此,本发明为该菌株建立适合的遗传操作体系,实现在酵母基因组上的遗传操作。为该菌株匹配不同的启动子-终止子组合及复制子组合,提供新型候选表达元件。另外,将本发明应用至CPV纳米颗粒基因工程疫苗,为进一步开发CPV疫苗奠定基础,也为其他动物病原基因工程疫苗的制备提供借鉴。
针对上述问题,申请人提供了适用于马克斯克鲁维酵母的双复制子表达载体并进行了专利申请,申请号为2024104862538(本申请提交前未公开),在该申请中,申请人全新构建了适用于马克斯克鲁维酵母的双复制子表达载体,该表达载体具有稳定性好,外源蛋白表达量大,转化率高的优点。在本发明中,申请人进一步利用该复制子,制备了犬细小病毒纳米颗粒,为犬细小亚单位疫苗做准备。
实现思路