本技术介绍了一种新型方法,利用AP-SWATH技术在植物中筛选并获取与诱饵蛋白相互作用的蛋白质。该方法首先在转基因植物中过表达带有亲和标签的诱饵基因,然后从植物中提取总蛋白,通过免疫沉淀技术分离出与诱饵蛋白相互作用的蛋白质。
背景技术
蛋白间相互作用是细胞各种基本功能的主要完成者,参与几乎所有的重要生命活动。因此,蛋白-蛋白相互作用研究以及建立相互作用的关系网络图,具有十分重要的意义,也是目前蛋白质研究领域的热点。亲和纯化结合SWATH(AP-SWATH)技术是近几年发展起来的研究蛋白相互作用的一种重要技术,该技术能够高特异性的准确富集到靶蛋白的特异性相互作用蛋白,并实现复合蛋白质的准确鉴定和定量。AP-SWATH技术是一种结合了亲和纯化(Affinity Purification)和SWATH-MS(Sequential Window Acquisition of AllTheoretical Mass Spectra)的蛋白质组学分析方法,常用于研究蛋白质复合物及其相互作用的详细组成。AP-SWATH结合了亲和纯化的特异性和SWATH-MS的全面性和定量能力,能够对捕获的蛋白质及其相互作用的蛋白质进行精确的定量分析,同时确保了所有肽段的质谱数据都被无偏地获取。AP-SWATH技术目前被广泛应用于生物医学研究,特别是在细胞信号传导过程中,能够研究信号传导通路中的关键蛋白及其相互作用伙伴。另外在蛋白质相互作用网络,能够绘制复杂的蛋白质相互作用网络,揭示生物过程的调控机制。重要的是,在疾病研究中,AP-SWATH也发挥着巨大作用,在癌症、神经退行性疾病等疾病的研究中,能够分析蛋白质相互作用的变化,寻找潜在的治疗靶点。总的来说,AP-SWATH技术已经全面应用于动物研究中,然而在植物研究中的应用还没有发掘。
植物由于固着的生长方式,长期暴露于自然环境中的各种压力。为应对这些挑战,植物进化出复杂的机制,以感知外部胁迫并触发从生理到分子、细胞水平的多层次响应。而构建如此复杂且精细的信号调控网络需依赖数千种分子的协同作用。在早期研究中,科学家们通过鉴定和量化蛋白质以试图揭示蛋白调控机制。然而,单纯的蛋白丰度变化信息提供的证据有限,仅能初步预测蛋白间潜在的关联,难以作为直接证据证明它们的相互关系,也无法确定这些关系是直接还是间接的。此外,许多蛋白质的功能发挥不一定伴随着丰度的变化。因为蛋白间的物理相互作用是信号转导和蛋白调控的基础,蛋白质可迅速对外部刺激做出反应,并通过与其他蛋白的相互作用,推动细胞调节过程,从而维持细胞和整个生物体的稳态。蛋白质互作组学技术具有全局性和高通量的优势,在蛋白质功能研究中发挥了重要作用。然而,这项技术在植物系统中的应用仍面临诸多挑战。植物具有多样化的代谢途径,而许多植物物种的基因组复杂且注释严重不足。此外,互作组学分析方法依赖遗传操作,而这在植物系统中,尤其是多倍体植物中,具有较大难度。
AP-SWATH作为一种快速、高选择性和灵敏的工具,用于检测在近生理条件下感兴趣蛋白(诱饵蛋白)与其相互作用蛋白(猎物蛋白)的相互作用。该技术利用抗体靶向诱饵蛋白,从而在天然条件下从细胞裂解物中捕获蛋白质复合物。然而,由于靶向植物蛋白的抗体有限且可能屏蔽诱饵蛋白的相互作用位点,尚没有在植物体内通过AP-SWA TH技术筛选互作蛋白的报道。
实现思路