本技术公开了一种敲除金属硫蛋白基因的sgRNA在制备治疗肿瘤双硫仑药物中的应用,通过RNA测序及数据分析寻找影响DSF耐药的分子机制,测序结果表明DSF处理组上调的基因有多个富集基因属于金属硫蛋白基因MTs家族,通过Real‑time PCR检测发现DSF处理的肿瘤细胞MTs的mRNA表达增加,结果与测序结果一致;为了明确MTs表达的上调是否与肿瘤细胞DSF耐药相关,利用基因敲除技术下调MTs基因家族中MT1X和MT2A的表达,敲除MT1X和MT2A的肿瘤细胞系对DSF敏感性增加,表明MTs可以作为DSF抗肿瘤治疗的靶点。
背景技术
肿瘤是一种特征为异常细胞的过度增殖的疾病,且该异常增殖得不到控制将导致肿瘤转移的发生,肿瘤未出现转移之前,初步治疗手段包括原发部位及邻近淋巴结的外科切除、药物化疗和放射治疗以防止肿瘤继续生长及转移。但是经过初步治疗的肿瘤细胞在很多情况下仍然存在于体内且演变为更加恶性的肿瘤,导致其更难治疗且更易转移。化疗和放射治疗的局限性在于其毒性,高剂量的放化疗虽然能诱导肿瘤细胞死亡,但对人体产生较大的毒副作用。因此,研发能够选择性诱导肿瘤细胞死亡而对正常细胞无杀伤力的特异性的抗肿瘤药物至关重要。
抗肿瘤新药的研发必须经过临床前期及临床试验的评估,此过程耗时漫长且代价昂贵。当前联合用药是治疗肿瘤的一种重要方式,该方法可通过多种不同机制来达到抗肿瘤的作用,而且还能减轻药物的不良反应。此外,“老药新用”为肿瘤治疗开拓了新视角,药物再利用可以缩短5~7年研发时间,减少研发资金。双硫仑(disulfiram,DSF)是一种被广泛应用于治疗酒精成瘾的药物,使用已有70多年历史,人体服用的安全性已得到充分证实,具有廉价及毒副反应轻的特点,近年来的研究表明,DSF在肿瘤治疗中发挥着重要的作用,由于越来越多研究证实了DSF的抗癌活性,因此大量临床试验开展以评价DSF治疗肿瘤的可行性,DSF作为一种戒酒药目前在抗肿瘤研究中发挥的作用备受关注,其优点在于安全、廉价且副作用小,在抗肿瘤治疗研究中具有较大优势。
虽然DSF在肿瘤治疗中拥有巨大的应用潜力,但化疗药物单独应用的疗法容易产生耐药反应,只有极少数的病人具有显著疗效,天然耐药和获得性耐药是阻碍DSF临床广泛应用的关键。有研究表明肝细胞肝癌对DSF联合铜治疗效果不佳,其机制与药物致使PDL1稳定性增加而导致机体免疫抑制有关。目前,DSF耐药的机制尚不完全清楚,前期研究采用DSF处理多种血液系统肿瘤细胞包括淋巴瘤和骨髓瘤细胞,发现绝大部分血液肿瘤细胞对DSF单独处理并不敏感,提示这部分细胞对DSF单独处理可能存在天然耐药;部分细胞DSF药物处理后在低浓度敏感而在高浓度耐药,提示此类肿瘤细胞若长期使用DSF抗肿瘤治疗可能会发生获得性耐药,只有极少部分细胞对DSF完全敏感,研究DSF肿瘤耐药的机制及提高肿瘤细胞对DSF的敏感性,增强DSF对肿瘤细胞的毒性对于DSF治疗肿瘤临床应用是本发明所需要解决的重点和难点。
实现思路