本技术公开了一种耐酸及耐热性能提升的葡萄糖氧化酶突变体及其构建方法与应用,属于生物工程技术领域。本发明以真菌Aspergillus sclerotiicarbonarius来源的葡萄糖氧化酶AsGODP为母本,将Glu148和Val179同步突变为Lys148和Ala179后得到突变体E148K/V179A。经实验发现,该突变体E148K/V179A在pH稳定性、热稳定性、75℃下半衰期以及催化性能方面,较野生型AsGODP均有明显提高。依据催化性能,将该突变体E148K/V179A用于面包烘焙中,能有效在发酵条件下提高面团筋度,改善面包质地,从而在面包烘焙行业中展现出巨大的开发潜力。
背景技术
葡萄糖氧化酶(GOD)是一种特性良好的糖蛋白,由两个相同的80kDa亚基通过二硫键连接在一起,其每个亚基含有1moL紧密结合但不共价连接的FAD片段作为辅助因子。GOD能利用分子氧为电子受体,催化d-葡萄糖(C6
H12
O6
)氧化为d-葡萄糖内酯(C6
H10
O6
)和过氧化氢。d-葡萄糖内酯可经非酶促水解反应生成葡萄糖酸和水。
葡萄糖氧化酶因为其特别的反应机制和安全的反应产物在医疗、食品、饲料等领域中得到了广泛的应用。葡萄糖氧化酶主要来源有曲霉属和青霉菌,但是目前已知的GOD的稳定性较差且催化活性较低,天然表达的葡萄糖氧化酶在超过55℃时,酶活力损失严重。这些缺陷极大地限制了GOD的应用范围,无法满足工业的需要。同时虽然国内外学家已聚焦于对酶分子进行定向进化和理性设计,但分子定向进化工作量大、随机性强而且投入成本高。而理性设计需要对GOD的功能结构有一定的了解,目前的GOD来源单一、已解析的结构少,难以进行精准的设计,所取得的成果依然不够显著。因此通过使用更多可靠的生物信息学技术来模拟和解析葡萄糖氧化酶的结构与功能,尝试对理论的关键结构和位点进行充分分析和改良,提高其催化活性和稳定性,能在很大程度上推动其在工业生产上的应用。
随着大型实验蛋白质数据库的访问的增加,以及高通量筛选(HTS)方法和人工智能算法的进步,极大的促进了蛋白质工程。目前已经开发出一系列合理的计算机辅助学习策略,如通过机器学习或深度学习方法进行预测酶蛋白序列变化所带来的功能变化以及从广泛的蛋白质数据集中识别序列或结构特征等。此外,也可利用深度神经网络和分子进化提取和识别蛋白质序列、结构、功能等特征信息。
实现思路